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HG TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品:果蠅胚胎細(xì)胞 血紅結(jié)合蛋白1封閉多肽 嗜衣原體通用PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠(EPI)ELISA檢測(cè)試劑盒 蘋果合(MS)活性比色法檢測(cè)試劑盒 磚紅海水桿菌 9號(hào)染色體開放閱讀框59抗體
更新時(shí)間:2024-01-12
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
HG TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 | 25T | A-PJ1081 |
HG TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 | 100TX20μl | A-PJ1081 |
描述: TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用加 A 法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,加 A 法的反轉(zhuǎn)錄效率遠(yuǎn)高于莖環(huán)法,因 此,采用該方法可極大的提高檢測(cè)靈敏度(原理見圖 1)。 該試劑盒操作簡(jiǎn)單,僅需要兩步即可輕松完成 miRNA 的 cDNA 合成,合成的 cDNA 可用于所有 miRNA 的后續(xù)定 量檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄完畢后采用特異性的上游引物和接頭引物 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,F(xiàn)AM 標(biāo)記 TaqMan 探針作為熒光報(bào)告基 團(tuán)進(jìn)行定量檢測(cè)(原理見圖 1)。 TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒專用于 miRNAs 分子的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn),轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 產(chǎn)物用于 TaqMan 定量 PCR 方法檢測(cè) miRNAs 分子
儲(chǔ)存:請(qǐng)置于-20°C,可保存 2 年;避免反復(fù)凍融
操作方法
1 按以下組分在 0.2 ml EP 管中配制應(yīng)液
miRNA (5~100 ng/μl) 4 μl
5×TaqMan miRNA RT Solution A 1 μl
注意:不建議使用 Total RNA,Total RNA 試驗(yàn)結(jié)果通常差
于 miRNA。
2 在 PCR 儀上按以下條件進(jìn)行加 A 反應(yīng):
37°C 30min
85°C 5min
3 反應(yīng)完畢后,在上述 5μl 反應(yīng)體系中加入如下試劑,并
混合均勻。
10×TaqMan miRNA RT Primer 2 μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 2 μl
H2O 11 μl
4 在 PCR 儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):
30°C 5min
55°C 60min
95°C 5min
獲得的 cDNA 產(chǎn)物可用于多個(gè)目標(biāo) miRNA 的檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄完畢后獲得的 miRNA cDNA,可加入 20~80μl ddH20 稀釋2~5 倍,通常取 2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 定量 PCR試劑盒檢測(cè)。
PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?
一、實(shí)驗(yàn)原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。
2.對(duì)于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。
ct值過晚
在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
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