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RNA/DNA提取操作過(guò)程重難點(diǎn)匯總
點(diǎn)擊次數(shù):313 更新時(shí)間:2024-09-19


       RNA和DNA對(duì)大家來(lái)說(shuō)都非常熟悉,其本質(zhì)都是核酸(一種由碳?xì)溲醯自亟M成的化合物),只是在結(jié)構(gòu)組成上有所不同,但是它們的基本組成單位都是核糖、磷酸和堿基。RNA中文叫核糖核酸,英文Ribonucleic Acid,與DNA相比,RNA的核糖比DNA多一個(gè)氧,因此DNA也稱為脫氧核糖核酸,再者就是兩者的堿基不同,RNA四種堿基主要是A/G/C/U,DNA是A/T/C/G。

      DNA的主要功能是記錄遺傳信息,而RNA主要功能是轉(zhuǎn)錄和翻譯DNA的遺傳信息,其實(shí)RNA還有其他的一些功能,比如RNA是很多病毒的遺傳信息,RNA也具有一定的催化作用。

RNA/DNA提取過(guò)程中的注意事項(xiàng):

1.避免污染

為避免RNase/DNase等污染,可以在操作前仔細(xì)清潔實(shí)驗(yàn)平臺(tái)、試劑盒、器皿和工具等,并使用經(jīng)RNase/DNase清洗的試劑和器皿。此外,應(yīng)該盡可能快地進(jìn)行樣品提取,以減少RNA/DNA降解和污染的可能性。

2.明確目的和選擇合適的方法

RNA和DNA在分子結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性上有所不同,并且不同的樣本類型也有不同的組織結(jié)構(gòu)和特征,因此需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖绢愋瓦x擇合適的RNA/DNA提取方法。例如,在提取RNA時(shí),需要更加注意RNase的污染問(wèn)題;而在提取DNA時(shí),則需要更加注意DNA的不斷降解問(wèn)題。

3.優(yōu)化樣品破碎步驟

樣品破碎對(duì)RNA/DNA提取至關(guān)重要。不同樣品類型需要不同的破碎方法,如高壓均質(zhì)機(jī)、超聲波等。在破碎過(guò)程中,需要注意破碎時(shí)間和功率控制,以避免過(guò)度破碎導(dǎo)致RNA/DNA的降解。

細(xì)胞破碎方法:超聲波法、高壓均質(zhì)法、玻璃珠法等都是常用的細(xì)胞破碎方法。

4.RNA/DNA的純化和濃縮

在提取和純化RNA/DNA過(guò)程中,需要去除可能存在的污染物,如蛋白質(zhì)、鹽等,并盡可能地減少DNA和RNA的降解。此外,在進(jìn)行RNA/DNA濃縮時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的方法,如酚/氯仿法或柱層析法等。

5.對(duì)提取的RNA/DNA進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估

在提取RNA/DNA之后,需要對(duì)其進(jìn)行確定性和質(zhì)量評(píng)估??梢允褂梅止夤舛扔?jì)和凝膠電泳等技術(shù)來(lái)測(cè)定RNA/DNA的濃度和質(zhì)量,并評(píng)估是否存在RNase/DNase污染等問(wèn)題。

6.RNase/DNase污染

RNase或DNase的污染很容易導(dǎo)致RNA/DNA降解,因此需要使用經(jīng)RNase/DNase清洗的器皿和試劑,并在操作中避免污染。

7.溫度控制:

RNA/DNA在高溫下易于分解,因此在提取RNA/DNA時(shí)要控制好溫度。在冷凍樣品之前,通常建議在低溫環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞或收集組織,以極 大程度地保護(hù)RNA/DNA。

8.RNA/DNA保存:

RNA/DNA應(yīng)該儲(chǔ)存在-80℃冰箱中,以避免降解和污染。在長(zhǎng)期儲(chǔ)存之前,建議進(jìn)行濃縮,并將RNA/DNA用RNase-free水稀釋至合適的濃度。

9.質(zhì)檢:

在提取RNA/DNA之后,需要對(duì)其進(jìn)行確定性和質(zhì)量評(píng)估。可以使用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定RNA/DNA的濃度和質(zhì)量,或者使用凝膠電泳來(lái)確認(rèn)RNA/DNA的大小和純度.


RNA/DNA提取的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法:

1.RNA/DNA濃度低:

如果提取得到的RNA/DNA濃度較低,則可以通過(guò)濃縮RNA/DNA溶液或在提取過(guò)程中增加樣品量來(lái)提高RNA/DNA的濃度。

2.RNA/DNA質(zhì)量不佳:

如果RNA/DNA分離后質(zhì)量不佳,則可能是由于RNase/DNase污染、過(guò)度破碎、過(guò)度處理等原因?qū)е碌?。需要仔?xì)檢查每個(gè)步驟,并采取相應(yīng)的措施來(lái)避免這些問(wèn)題。

3.提取RNA或DNA有選擇性:

有時(shí),RNA或DNA的提取會(huì)出現(xiàn)選擇性問(wèn)題,即只能提取其中一種。這通常是由于使用的試劑或條件不適合同時(shí)提取RNA和DNA所導(dǎo)致的??梢試L試更換試劑或優(yōu)化條件,以獲得更好的RNA/DNA提取結(jié)果。

4.樣品殘留:

在提取RNA/DNA時(shí),倒掉廢液后可能會(huì)有樣品殘留在管子或器皿中。這可能會(huì)導(dǎo)致RNA/DNA的污染和降解,因此需要特別小心地清潔所有器皿和工具,確保沒(méi)有任何殘留物。

總之,在進(jìn)行RNA/DNA提取時(shí)需要注意許多方面,并且可能會(huì)遇到一些問(wèn)題。如果出現(xiàn)問(wèn)題,需要仔細(xì)檢查每個(gè)步驟并逐步解決問(wèn)題,以確保最終得到高質(zhì)量的RNA/DNA樣本。


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