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RNAse的無(wú)處不在導(dǎo)致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的質(zhì)量，在RNA純化過(guò)程中要特別注意的10個(gè)問(wèn)題介紹。
1、在收獲組織及細(xì)胞死亡之后，應(yīng)立即滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解。以下3個(gè)方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：
1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。
2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保瞬間令RNA酶失活
3）立即將樣品置于RNAlater? Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一種水相、無(wú)毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm），這樣RNAlater才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
2、使用正確的細(xì)胞或組織儲(chǔ)存條件
在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲(chǔ)存在-80°C，千萬(wàn)不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會(huì)導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。
RNAlater使樣品儲(chǔ)存更為便利。儲(chǔ)存在RNAlater中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)星期，在4°C可穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月，或永jiu 保存在-20°C。有關(guān)RNAlater的更多信息請(qǐng)參考 .
3、徹di 勻漿樣品
細(xì)胞或組織的徹di 勻漿對(duì)RNA提取來(lái)說(shuō)，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來(lái)選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過(guò)簡(jiǎn)單的渦旋震蕩來(lái)勻漿；而動(dòng)物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌則常常需要更加劇烈的方法。比如說(shuō)細(xì)菌的細(xì)胞壁，就需要酶消化來(lái)實(shí)現(xiàn)徹di的細(xì)胞裂解和RNA的最大回收。有關(guān)各種不同的樣本類型，哪些方法是最適he的勻漿方法，請(qǐng)參考 .
4、在RNA提取之前預(yù)處理樣品裂解液
對(duì)于某些樣品來(lái)說(shuō)，在勻漿之后，RNA提取之前，還需要一些額外的處理步驟。對(duì)于脂肪含量高的組織，像腦組織和脂肪組織得到的裂解液，就需要通過(guò)氯仿抽提來(lái)去除脂類，從而提高RNA產(chǎn)量。許多植物組織中富含多酚和多糖，會(huì)降低RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，用Plant RNA Isolation Aid 預(yù)處理裂解液可去除這些難以處理的成分。
5、選擇最好de RNA分離方法
現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前zui 簡(jiǎn)單也是zui 安全的方法是柱式分離，如RNAqueous? 或RNAqueous-4PCR Kit。因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單，所以這些步驟特別適用于同時(shí)處理多個(gè)樣品。如果是處理復(fù)雜的組織，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（腦和脂肪組織）的樣品，就推薦使用更加嚴(yán)格的、基于酚處理的RNA分離方法，如ToTALLY RNA?。更多的信息請(qǐng)參考 。更多方法選擇，請(qǐng)參考
6、DNase處理
如果提取的RNA將用于RT-PCR，我們推薦用DNase處理純化的RNA樣品以去除殘留的DNA污染。當(dāng)樣品來(lái)源于富含DNA的組織，如脾臟時(shí)，DNase處理也是一個(gè)好辦法 。RNAqueous-4PCR Kit的實(shí)驗(yàn)流程中包含了DNase處理的步驟，并提供了必需的試劑（DNA酶I）。DNA-free? DNase treatment & Removal Reagents 則可用于去除用各種方法制備的RNA樣品中的DNA污染。這兩個(gè)產(chǎn)品都提供了高質(zhì)量的DNase I，優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，和DNA酶消化處理后簡(jiǎn)單快速去除DNase的方法，無(wú)需使用有機(jī)溶劑和熱處理。
7、減少環(huán)境RNase的暴露
為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個(gè)RNA制備過(guò)程中，當(dāng)RNA離開(kāi)強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時(shí)，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是無(wú)所bu在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣?xùn)|西都是無(wú)RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺(tái)、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如RNaseZap? 或RNaseZap Wipes 來(lái)處理過(guò)。必須保證一直使用無(wú)RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。
8、正確的沉淀
純化得到的RNA可能需要通過(guò)沉淀來(lái)濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如糖原glycogen,、酵母yeast RNA或linear acrylamide）的方法。當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時(shí)，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓珼NA污染。酵母RNA和未處理的糖原會(huì)給樣品帶來(lái)核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過(guò)分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。
9、重懸
許多RNA提取步驟的最后一步是溶解純化的RNA沉淀。理想的重懸溶液應(yīng)該滿足3點(diǎn)要求：無(wú)RNase污染、較低的pH值（pH 6-7）、含有螯合劑，以保護(hù)RNA不受帶入的RNase的降解。（THE RNA Storage Solution能滿足以上所有標(biāo)準(zhǔn)。）為了幫助溶解，RNA沉淀可置于重懸溶液中在65°C孵育5分鐘，并不時(shí)輕搖以幫助溶解。
10、儲(chǔ)存
如果只是短期儲(chǔ)存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20°C；如果是長(zhǎng)期儲(chǔ)存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲(chǔ)存在-80°C，但保存于醋酸銨/乙醇溶液中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會(huì)避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。
